MÉTODOS ESPECTRO ANALITICOS Y CROMATOGRAFICOS
Un método analítico, depende del sistema químico observado y de la calidad de los instrumentos utilizados para observarlo.
La cantidad de ruido presente en un sistema químico y/o instrumental determina la concentración de analito más pequeña que puede medirse con exactitud, y también fija la precisión de la medida a concentraciones más grandes. Conforme las concentraciones disminuyen hacia el nivel de traza o las fuentes de señales se tornan débiles, el problema de distinguir las señales respecto al ruido se hace cada vez más difícil, ocasionando una disminución en la exactitud y la precisión de las medidas. La capacidad de un sistema instrumental para discriminar entre señales y ruido se expresa, usualmente como la relación señal-ruido:
S/N = amplitud media de la señal / amplitud media del ruido
Varios parámetros permiten caracterizar una medida o un método analítico:
1. El límite de detección mínimo, S, se define como la razón de cambio en la respuesta del instrumento al cambiar el correspondiente estímulo: concentración, temperatura, masa, etc, por ejemplo:
S = dG/dC donde G = Señal de salida, C = Concentración del analito
La sensibilidad de un método analítico, S, se define como la pendiente, m, de la curva de calibración, ya que ésta define la razón de cambio de la propiedad medida por unidad de concentración.
Para los métodos espectrofotométricos, S = mcal = D A/ D C de la curva de calibración Absorbancia vs. Concentración.
La sensibilidad también puede expresarse en términos de concentración como:
S = 0.0044/ mcal relación cuyas unidades corresponden a concentración.
El valor 0.0044 es la absorbancia que corresponde a la mínima diferencia medible con precisión ( D T = 1.0% T ) en instrumentos con escala de % T entre 0.0 y 100.0 ; una absorción de 1% corresponde a 0.0044 unidades de absorbancia, aplicando:
A = log [100 / (100-% absorción) ] = log [100 / ( 100-1)] = 0.00436
Una respuesta no lineal en la gráfica de A vs C indica un cambio en el valor de la sensibilidad en función de la concentración. Conforme la concentración del analito se aproxima a cero, la señal desaparece dentro del ruido y se rebasa el límite de detección.
2- El límite de detección mínimo (LD) ó la concentración mínima detectable es un parámetro estadístico que ha sido muy controvertido. Diferentes autores han dado diversas definiciones y metodologías para su determinación experimental. Actualmente, algunos autores lo definen como la cantidad o concentración mas pequeña del analito que produce una señal XL significativamente diferente de la señal del ruido de fondo Xb.
El criterio utilizado para que la concentración mínima detectable sea distinguible con certeza (significativamente diferente o estadísticamente diferente) del ruido de fondo es que la diferencia entre la señal del analito, de concentración muy baja, y la señal de los blancos sea igual a tres veces la desviación estandar de la señal de los blancos, utilizados para medir el ruido de fondo. Es decir que:
en donde XL es la señal límite, obtenida para la concentración mínima detectable de analito, Xb es la señal promedio de los blancos, y sb es la desviación estándar de las lecturas del blanco.
Experimentalmente, el límite de detección se determina involucrando todos los factores que afectan la medida y se define , en general, para obtenerlo en unidades de concentración como:
LD = 3sb / mcal bajas concentraciones
Donde, sb = desviación estándar de los blancos, mcal es la pendiente de una curva de calibración del sistema, preparada a muy bajas concentraciones. Este criterio es recomendado por IUPAC.
Aplicado a los métodos espectrofotómétricos, entonces, sb = desviación estándar de los blancos en absorbancia y mcal pendiente de la curva de calibración (A vs C) en unidades de Absorbancia/Concentración, por lo tanto, al calcular la relación el límite de detección se obtiene en unidades de concentración.
Otros autores, utilizan para calcular el límite de detección, la siguiente expresión:
En donde C nominal es la concentración del patrón de baja concentración y C promedio corresponde al promedio aritmético, de las concentraciones halladas experimentalmente por interpolación (después de interpolar la absorbancia en una curva de calibración), de por lo menos diez replicas de la solución de baja concentración. Este criterio aunque no lo recomienda IUPAC es muy utilizado en diferentes laboratorios.
3- El límite de detección máximo: Se define como la máxima concentración de un analito que se puede analizar. Generalmente, lo que ocurre, es que las soluciones se hacen tan concentradas, que en el caso de los métodos espectrofotométricos, toda la luz es atrapada por el analito y tenemos una situación equivalente al ajuste del 0 % de transmitancia. En este caso, el detector no diferencia dos soluciones de concentraciones altas. La determinación queda limitada a concentraciones menores del valor de límite de detección máximo, pero en este caso, a diferencia del límite de detección mínimo, el problema se soluciona fácilmente mediante una dilución adecuado. En el caso del límite de detección mínimo, las soluciones son concentrar la muestra o usar otra técnica con límite de detección menor. El límite de detección máximo, se puede obtener de la parte superior de la curva de Ringbom, como se verá más adelante.
4-Límite de cuantificación: Corresponde a la cantidad o concentración del analito a partir de la cual es confiable realizar determinaciones cuantitativas y se define como:
Límite de cuantificación = LQ = 10s b / m cal bajas concentraciones
5- La precisión de una medida o de un método analítico también se determina por un parámetro estadístico que indique la dispersión de las medidas con relación al valor medio la mediana o la moda de la medida realizada. Generalmente se expresa por la desviación media o desviación estándar. En los métodos espectrofotométricos se determina tanto la precisión del instrumento como la del método en general..
La precisión del instrumento se define entonces por el error instrumental o error fotométrico D T. Experimentalmente se obtiene midiendo la transmitancia de unas 10-20 porciones de una solución y calculando la desviación media de esas mediciones. Cada medida debe incluir las operaciones de vaciado, llenado y colocación de la celda en el porta celdas, así como el ajuste del 0.0% T (con el obturador) y del 100% T con el disolvente puro.
6- El error fotométrico o instrumental que indica la repetibilidad de las lecturas en un espectrofotómetro es común tomarlo como:
D T = 2S T- T promedio / n , el doble de la sumatoria de las desviaciones de las lecturas de T con respecto a la transmitancia promedio T , en valor absoluto, dividido entre el número de datos, n.
Sobre la determinación de la precisión del método analítico se comentará posteriormente.
La calidad de las medidas, como se observa, depende del ruido de fondo, ya sea del ruido originado por los componentes del instrumento o ruido instrumental o el ruido originado por la matriz de análisis del sistema químico.
Las principales fuentes de ruido instrumental asociados a dispositivos eléctricos o electrónicos en estado sólido son:
- Ruido térmico: originado por el movimiento térmico de los electrones en las resistencias u otros elementos resistivos de un circuito eléctrico. Su magnitud se calcula por:
Vrms = ( 4kTR D f )1/2
Donde Vrms es el ruido medio cuadrático en el voltaje, dentro de una banda de frecuencias D f, k constante de Boltzmann (1.38x10-16 erg / grado) ,T temperatura absoluta.
- Ruido de disparo o de golpeteo: tiene origen cada vez que una corriente transfiere electrones u otras partículas cargadas a través de uniones o cuando los portadores de carga atraviesan las uniones n-p, o llegan a la superficie de los electrodos. Su magnitud se calcula por:
irms = (2IeD f )1/2 ,
Donde i rms es la fluctuación de la corriente media cuadrática relacionada con la corriente media I, e es la carga del electrón 1.6x10-19 coulombs y D f el ancho de la banda de frecuencia considerado.
- Ruido de parpadeo o fluctuación: Su magnitud es inversamente proporcional a la frecuencia de la señal observada, se denomina ruido 1/f. Su magnitud es importante para frecuencias menores que 100 Hz.
Existe otro tipo de ruido que es el ambiental el cual implica la transferencia de energía desde los alrededores hasta el sistema de medición. Las fuentes comunes son: campos eléctricos y magnéticos, producidos por las líneas de transmisión de potencia a 60Hz y sus correspondientes armónicos; energía radiante reflejada, vibraciones mecánicas y las interacciones eléctricas entre los diferentes instrumentos.
El ruido instrumental se mide por la desviación estándar de la señal producida por los blancos, razón por la que este parámetro aparece en la determinación del límite de detección.
METODO COLORIMÉTRICOS
Fotometría.
Dentro de los métodos colorimétricos, un gran número de determinaciones que se realizan habitualmente en el laboratorio, utiliza medidas de energía radiante, ya sea emitida, absorbida o reflejada. Estas medidas se determinan a través de técnicas fotométricas. Las técnicas fotométricas tienen su fundamento en las interacciones de las radiaciones electromagnéticas sobre la materia.
Radiaciones Electromagnéticas
Pueden considerarse como un conjunto de corpúsculos, llamados fotones, los cuales llevan asociada una onda. La energía de radiación esta relacionada con la longitud de onda. Las longitudes de onda más cortas poseen mayor energía que las longitudes de onda más largas. De tal manera que podemos hablar de un espectro electromagnético constituido por las radiaciones electromagnéticas, mismo que se ha dividido en varias regiones, de acuerdo con la longitud de onda (λ) y la energía.
1. Rayos X (1-100 nm)
2. Ultravioleta (100-390 nm)
3. Visible (390-700 nm)
4. Infrarrojo (700-100 000 nm)
5. Microondas (100 000- 1 000 000 nm)
MÉTODO ESPECTROFOTOMETRICO
un método espectrofotométrico para que sea cuantitativo son:
Que el método sea selectivo al analito que se desea analizar.
Que esté libre de interferencias que afecten el resultado analítico ó que las interferencias se puedan controlar.
Que tenga alta precisión y exactitud.
Que tenga una alta sensibilidad y
Que el límite de detección corresponda a una concentración baja.
Experimentalmente para el establecimiento de un método espectrofotométrico, después de optimizar las condiciones químicas del sistema (pH, temperatura, control de interferentes, concentración adecuada de reactivos, solvente apropiado, protección a la luz para evitar reacciones fotoquímicas, etc.) que garanticen que se tiene la especie de interés en condiciones adecuadas para la medida, se establecen los siguientes parámetros:
1-Longitud de onda analítica: Se escoge mediante el registro y/o la observación de la curva espectral o espectro de la sustancia que indicará si es adecuado tomar la longitud de onda de máxima absorción u otra banda característica de la sustancia como longitud de onda para realizar las medidas, la longitud de onda escogida se conoce como longitud de onda analítica.
2- Intervalo óptimo de concentraciones : Se debe trabajar, en lo posible, con concentraciones que permitan que se cumpla la ley de Beer, con el fin de obtener una curva de calibración que tenga una relación lineal.
Para obtener el intervalo óptimo de concentraciones primero se construye la curva de Ringbom, que consiste en construir una gráfica de absortancia (100- %T) vs. lg Concentración. Los datos se obtienen preparando una serie de soluciones patrón del analito, que cubran una variación de por lo menos dos órdenes de magnitud de concentración de este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de onda analítica escogida. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que presentara una relación lineal entre absorbancia y concentración. En esta gráfica, los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor para los límites de detección mínimo y máximo, respectivamente.
3- Curva de Calibración: Con los datos de la parte recta de la curva de Ringbom se construye la curva de calibración Absorbancia ( en las ordenada ) vs. Concentración (en la abcisa) previo ajuste de los datos por mínimos cuadrados (que incluyen el punto 0.0, 0.0000) revisando que el coeficiente de correlación sea estadísticamente significativo. La gráfica de la recta de calibración debe incluir los puntos experimentales. La recta ajustada también se conoce con el nombre de curva de trabajo.
por ejemplo:
La utilización de curvas de calibrado obtenidas a partir de series de patrones es, posiblemente, el método más utilizado. Consiste en medir la propiedad analítica de interés, P1, P2, P3, etc. en una serie de muestras de composición conocida, C1, C2, C3, etc. y preparadas todas ellas en las mismas condiciones
4- Curva de Crawford: Con todos los datos obtenidos para la curva de Ringbom, se calcula el error analítico por unidad de error fotométrico, y se construye la curva del error para el sistema de interés, previa determinación experimental del error fotométrico o instrumental. Si no se conoce D T, entonces solo se puede obtener (D C/C)/D T.
5- Sensibilidad del método analítico: Se calcula la sensibilidad del método de la pendiente de la curva de calibración y se expresa como se indicó anteriormente.
Límite de detección: Se preparan, por lo menos, diez soluciones del blanco de procedimiento, se leen las transmitancias o absorbancia respectivas y se calcula como se indicó anteriormente.
Precisión del método. Carta de dispersión: La precisión indica la dispersión de las medidas o la variabilidad del método. La precisión se mide mediante un parámetro estadístico de dispersión, generalmente se utiliza la desviación estándar, S:
S = [å ( X- X promedio)2 /( n -1)] 1/2
donde X es la variable medida concentración, absorbancia, etc., X promedio el valor medio de la variable medida y n el número de medidas o datos. Un valor pequeño de desviación estándar con relación al valor medio, indica que las medidas presentan poca dispersión o que son precisas. En muchos casos, se observa si todos los datos de una serie de medidas caen entre el valor medio y más o menos dos desviaciones estándar, X promedio ± 2S, si es así, se dice que el método tiene una precisión del 95 %.
El procedimiento que se sigue para obtener los datos que permitan el calculo de la desviación estándar en concentración, se ilustra a continuación: Se preparan, por lo menos, diez soluciones patrón del analito de la misma concentración (concentración que produzca una transmitancia cercana a 37.0%) siguiendo todos los pasos del procedimiento, se lee su transmitancia, se calcula la absorbancia para cada solución, se interpolan los valores en la curva de calibración y se obtienen las concentraciones respectivas. Con las concentraciones halladas se obtiene el valor promedio de concentración y la desviación estándar, S, que corresponde a la medida de la dispersión de los datos. Se construye la carta de dispersión de los datos y se calcula el coeficiente de variación del método así: % Coeficiente de variación = (desviación estándar / valor medio)
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