PARÁMETROS DE VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS


Las características de desempeño de un método analítico se expresan en función
de los parámetros analíticos. Estos parámetros analíticos considerados en la
validación son los siguientes:

- Precisión
- Exactitud
- Límite de Detección
- Límite de Cuantificación
- Especificidad*
- Selectividad
- Sensibilidad
- Linealidad
- Rango

* Algunas autoridades hacen la distinción entre especificidad y selectividad.
Ambos términos se refieren a la habilidad del método de proveer un cálculo de
analito en presencia de otros componentes de una muestra. La diferencia está en
que la selectividad del método provee exactitud de resultados para todos los
analitos de interés, mientras que la especificidad está referida a la exactitud de
resultados para un analito y otros de interés pueden interferir uno con otros. A
continuación definiremos los diferentes parámetros analíticos de validación junto
con una breve explicación de como puede medirse.

PRECISIÓN

La precisión de un método analítico es el grado de concordancia o de dispersión
de los resultados de la prueba, cuando el procedimiento se aplica repetidamente a
muestras múltiples de una muestra homogénea. Es la medida de cuán cerca están
los valores unos de otros para un número de mediciones bajo las mismas
condiciones analíticas. La precisión de un método analítico generalmente se
expresa como la desviación estándar relativa (RSD) cuyo valor debe ser menor o
igual al 2% para análisis por HPLC (Coeficiente de Validación).
La ICH (International Conference of Harmonization), ha utilizado tres componentes
para definir la precisión:

- Repetibilidad o Capacidad de repetición
- Precisión Intermedia
- Reproductibilidad o Capacidad de reproducción

Repetibilidad o Capacidad de Repetición

Expresa la precisión del método de análisis cuando es realizado por un mismo
analista bajo condiciones iguales como equipo, reactivo e intervalos de tiempo. La
repetibilidad mide las variaciones dentro de un mismo laboratorio. Se determina
analizando un número significativo de muestras tomando de un lote homogéneo.
Los resultados se acompañan del valor medio, desviación estándar que debe ser
menor o igual al 2%, coeficiente de variación e intervalo de confianza del valor
medio, cuya ecuación es:

μ = x ± ttabla . S
------------
n

Donde :

X : Media de los resultados
S : Desviación estándar
n : Número de mediciones

La Repetibilidad es el resultado del método de operación sobre un corto intervalo
de tiempo bajo las mismas condiciones de trabajo.

Reproducibilidad o capacidad de reproducción

Expresa la precisión del método de análisis cuando es realizado por diferentes
analistas y bajo condiciones ligeramente diferentes, tales como distintos
laboratorios, reactivos de distintas marcas, equipo de trabajo diferente, etc. La
reproducibilidad mide las desviaciones interlaboratorios y se determina analizando
un número significativo de muestras, tomadas de un lote homogéneo, en
diferentes laboratorios, por distintos analistas y utilizando distintos equipos,
aplicando el mismo procedimiento analítico. Los resultados se calcula usando la
siguiente fórmula:
μ = x ± ttabla . S
-----------
n

Donde :

X : Media de los resultados
S : Desviación estándar
n : Número de mediciones


EXACTITUD

La exactitud de un método analítico es la proximidad entre los resultados,
obtenidos por ese método y el valor real. La exactitud puede a menudo expresarse
como un porcentaje de recuperación, por medio de la valoración de cantidades
conocidas agregadas de analitos. Representa el grado en que un método analítico
es exacto para los fines propuestos. Para formulaciones como tabletas, esto
puede significar una evaluación potencial de la interacción del principio activo con
los excipientes en un diluyente. Este test evalúa la especificidad del método en la
presencia de los excipientes bajo las condiciones de trabajo observadas para el
análisis de un producto. Para el análisis de un producto farmacéutico la exactitud
es evaluada por el análisis de una mezcla con cantidades conocidas de
componentes.
Entre los procedimientos para determinar la exactitud de un método de análisis
cabe cita:
- Comparar el método propuesto con otro cuya exactitud haya sido ya establecida.
- Comprobar este parámetro, utilizando como muestra un patrón de calidad
certificada.
- Aplicar el método analítico a una muestra o mezcla de excipientes a las que se
añaden cantidades conocidas de un analito.
Mediante este último método se agregan cantidades conocidas de analito o
mezcla de excipientes, tanto por encima como por debajo del nivel normal
previsto. A partir de los resultados obtenidos luego de aplicar el método propuesto,
se calcula la exactitud como el porcentaje de analito recuperado por medio de la
valoración mediante la siguiente fórmula:

%R = X x 100
-------
Xa

Donde:

%R : Porcentaje de recuperación
X : Cantidad de analito hallado
Xa : Cantidad de analito añadido

Donde el RSD de la cantidad de analito añadido con la cantidad de analito
recuperado debe ser menor al 2%. Se procede según el test “T” de student; El
criterio de aceptación es si el “T” experimental es menor al “T” de las tablas, para
(n-1) grados de libertad y un nivel de significación del 95% (p=0,05), entonces no
existe diferencia significativa entre la recuperación media y la cantidad de analito
añadido. El “T” experimental se calcula mediante la siguiente fórmula:

texp = /100 – R/ n
----------
RSD

Donde:
R : Porcentaje de Recuperación Promedio de todos los datos
n : Numero de datos o mediciones.
RSD : Desviación estándar relativa o coeficiente de variación del total de
mediciones.


SENSIBILIDAD

Se define como la capacidad de un método analítico para detectar pequeñas
variaciones en las concentraciones de analito en la muestra.
Se calcula inyectando concentraciones menores a las del rango de trabajo y en
esas concentraciones se determina la ecuación de la recta:

Y = bx + a

Donde:

X : La concentración del analito
Y : Valor de loa respuesta en área del pico cromatográfico
b : Valor de la pendiente de la recta
a : Valor del intercepto de la recta con el eje y

Extrapolando a una concentración dx = 0 se obtiene el valor de Y (blanco),con las
datos de la desviación estándar para cada concentración de la curva de
calibración a bajas concentraciones se calcula la ecuación que represente a la
recta: Concentración Vs Desviación estándar. De la ecuación de la recta
extrapolando la desviación a concentración cero, tenemos el Sbl, cuyo valor se
empleara en la determinación del límite de detección y el límite de cuantificación.


LÍMITE DE DETECCIÓN

El límite de detección es un parámetro de pruebas de límite. Es la concentración
más baja de analito que pueda detectarse, pero no necesariamente cuantificarse,
bajo las condiciones experimentales establecidas. De esta manera, las pruebas de
límites solamente fundamentan que la concentración del analito está por encima o
por debajo de un nivel de seguridad. Este parámetro hace referencia a la mínima
concentración del compuesto en estudio que es posible detectar con certeza, es
decir que se puede diferenciar la respuesta dado por un blanco, el cual contiene
todos los componentes de la muestra menos el compuesto de estudio. El límite
de detección se calcula mediante la fórmula:

Lim Detección = / Ybl + 3 Sbl /b

Donde:

Ybl : Valor de Y a concentración 0
Sbl : Desviación estándar a concentración 0
b : Valor de la pendiente

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación es un parámetro de las valoraciones cuantitativas de
compuestos que se encuentran en baja concentración en la matriz de una
muestra, como por ejemplo impurezas en materias primas y productos de
degradación en productos terminados. Se define como la mínima concentración
del analito que puede determinarse con precisión y exactitud aceptable en una
muestra, bajo las condiciones establecidas. El límite de cuantificación se calcula
mediante la fórmula:

Lim Cuantificación = / Ybl + 10 Sbl /b


Donde:

Ybl : Valor de Y a concentración 0
Sbl : Desviación estándar a concentración 0
b : Valor de la pendiente


LINEALIDAD Y RANGO

La linealidad de un método analítico es su capacidad de producir resultados que
son directamente proporcionales o mediante una transformación matemática bien
definida se convierten directamente proporcionales a la concentración de analito
dentro de un intervalo dado. La linealidad generalmente se expresa en función de
la varianza alrededor de la pendiente de la recta de regresión calculada, según
una relación matemática establecida, a partir de los resultados obtenidos mediante
el análisis de muestra con diferentes concentraciones de analito. Esta relación
matemática se expresa de la siguiente manera:

Y = bx + a

Donde:

X : La concentración del analito
Y : Valor de loa respuesta en área del pico cromatográfico
b : Valor de la pendiente de la recta
a : Valor del intercepto de la recta con el eje y

El rango de un método analítico es el intervalo entre los niveles superior e inferior
del analito, incluyendo estos valores, que se ha demostrado son determinados con
precisión, exactitud y linealidad, empleando el método tal cual esta escrito. La
linealidad de un método analítico se determina mediante el tratamiento
matemático de los resultados obtenidos a partir del análisis de muestras con
concentraciones de analito a lo largo del rango propuesto por el método. El
tratamiento normalmente es el cálculo de una recta de regresión, por el método de
cuadrados mínimos, de los resultados de la prueba frente a las concentraciones
de analito. En algunos casos, para obtener la proporcionalidad entre el resultado
de la valoración y la concentración de la muestra, puede ser necesario someter los
datos de la prueba a una transformación matemática antes del análisis de
regresión. La pendiente de la línea de regresión y su varianza es una medida
matemática de la linealidad; la ordenada al origen es una medida de la desviación
potencial de la valoración. El rango del método se valida comprobando que el
método analítico proporciona una precisión, exactitud y linealidad aceptables
cuando se aplica a muestras que contienen el analito en los extremos del rango
así como dentro del rango.


EJEMPLO:


Validación de método analítico de valoración de naproxeno sódico 550mg tableta

Como ya hemos dicho anteriormente,la validación del método analítico es parte integral del sistema de control de calidad, puesto que confiere fiabilidad a los resultados analíticos obtenidos en un laboratorio de análisis, a fin de asegurar que un medicamento cumpla los parámetros de calidad establecidos. En este trabajo presentamos la validación de un método analítico de valoración de Naproxeno Sódico 550 mg en tabletas, utilizando la técnica de cromatografía liquida de alta performance establecido en la USP 28. Los parámetros estadísticos empleados en la validación son: la linealidad; que mide la capacidad del método analítico para producir resultados que son proporcionales a la concentración del analito, lo cual queda demostrado en la validación al obtener un coeficiente de correlación r=0.99992, siendo el valor minimo permisible de 0.997. la exactitud mide la proximidad de los resultados obtenidos por este método y el valor real. Al aplicar el test de student para demostrar la exactitud del método analítico se obtuvo un texp(1.1932) que es menor al t de las tablas (2.306); por lo tanto no existe diferencia significativa entre la recuperación media y la cantidad añadida de analito, es decir que el porcentaje de recuperación del analito es muy cercano al 100%.
La precisión del método analítico es el grado de concordancia o de dispersión de los resultados de la prueba. Los valores de RSD obtenidos, (0.17% para repetibilidad y 0.16% para precisión intermedia), nos demuestran la precisión del método analítico donde el valor máximo permitido es un RSD=2.0%.
La selectividad y especifidad y especificidad determinan la capacidad del método analítico de medir el contenido de Naproxeno sódico, sin interferencias de parte de los excipientes o productos de degradación del principio activo.
En el método analítico se obtuvo picos cromatográficos de naproxeno sódico con tiempos de retención similares para la muestra y el estándar, por lo tanto el método es específico. El standard y el análisis del placebo nos demuestra que ningún excipiente interfiere con el pico del principio activo, como tampoco se ha detectado la presencia de productos de degradación del naproxeno sódico al realizar el análisis del principio activo sometido a diferentes procedimientos de degradación forzada, por lo tanto el método es selectivo.
Inicialmente se estudió los fundamentos del HPLC, luego la definición de tipo de columna y fase móvil más conveniente para la validación, el tipo de equipo que se utilizó, continuando con un análisis químico del principio activo que incluye su estructura química y por último el desarrollo de la validación del método.